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3 乳酸菌青贮秸秆的研究趋势
近年来随着分子生物学的飞速发展和对乳酸菌研究的进一步深入，为人们提供了一个采用基因重组技术把外源纤维素酶的基因导入乳酸菌中的途径。应用这种构建的工程乳酸菌可以省去纤维素酶的生产和添加这一步骤，节约成本，因而，近年来，国内外利用乳酸菌表达外源纤维素酶基因的报道越来越多。Franca Rossi等（2001）将枯草芽孢杆菌的celA基因连接到大肠杆菌-植物乳杆菌穿梭载体pGIP73上，然后转化植物乳杆菌L.plantarum Lp80和L.plantarum B41。结果目的蛋白产生了43～59U/L的酶活。Liu等（2005）将瘤胃分解纤维素菌Fibrobacter Succinogenes的β-葡聚糖酶基因和Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因xynCDBFV以及Piromyces rhizinflata的纤维素酶基因eglA分别连接到表达载体pNZ3004上，电转化乳杆菌L.reuteri Pg4，检测到了目的基因表达。Bates EEM （1989）、J S Cho （2000）等先后将内切葡聚糖酶基因从芽抱杆菌中克隆并分别在植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、溶血乳杆菌Lactobacillus johnsonii及乳酸杆菌Lactobacillus gasseri中表达；Heng NCK（1997）等将浸麻芽饱杆菌Bacillus macerans来源的内切葡聚糖酶基因在瑞士乳杆菌Lactobacillus reuteri中表达。赵莹（2008）将能降解纤维素酶系中的葡萄糖外切酶CBH11基因在非抗生素抗性表达载体（pW425t）进行重组后，将其在乳酸杆菌中进行表达并对其活性检测，结果显示，转酸性纤维素酶基因工程乳酸菌具有分泌酸性纤维素酶的功能。其中，从真菌中分离的纤维素酶可以在青贮过程中起到良好的效果。这些酶可以有效地水解其中的结构多糖，产生更多的被产酸菌株直接利用的原料物质—单糖。史瑞（2010）将来自瑞氏木酶属的纤维素酶基因CBHⅡ与表达载体pET30a重组，构建了重组质粒pETCBH。将重组质粒转化Rosetta宿主菌，获得了重组菌株Rosetta（pETCBH）；利用IPTG诱导重组菌株Rosetta（pETCBH），并通过pNPC法测定了重组纤维素酶CBHⅡ的活性，其活性为2.677U/mL。并建立了一种新的REAL-TIME RT-PCR分析方法，同时利用pNPC法测定了工程菌的酶活力，为构建青贮用转纤维素酶基因乳酸菌提供了一种技术路线和对其进行相关指标评价的方法。山东大学孙磊（2005）用来自枯草芽抱杆菌Y-106的纤维素酶基因连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e上，电转化导入乳酸乳球菌MG1614，携带的纤维素酶基因在乳酸乳球菌中表达并有活性，其胞外酶活为0.133U/mL。
随着转基因生物技术的发展及研究水平的不断提高，通过对乳酸菌的育种和生物学特性的认识的不断深入和对纤维素酶基因的筛选及克隆的研究，将能得到更为优良的青贮乳酸菌基因工程菌，将会大大提高秸秆青贮的效果。4 小结
利用乳酸菌青贮秸秆一直是国内外研究的焦点，但由于菌种及来源、使用剂量不同，作用的秸秆也不相同，所取得的结果也不一样。用乳酸菌和纤维素酶联合发酵秸秆取得了较好的效果，应用分子生物学技术，将纤维素酶基因转入乳酸菌中，将是乳酸菌青贮秸秆的研究重点和趋势。
添加剂青贮
为提高饲料资源的有效利用且保证获得高品质青贮饲料， 学者们除了对混合青贮进行研究外，还致力于添加剂青贮的研究。添加剂青贮是当条件不能满足获得优质青贮饲料时，需要额外添加添加剂以补充所缺乏条件的青贮方式。青贮添加剂主要包括化学添加剂和生物性添加剂。
3.2.1 化学添加剂青贮
化学添加剂主要是酸类和糖类。酸类主要包括盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸及丙烯酸等，主要被用于pH 的调节，起到快速酸化，直接形成适于乳酸菌繁殖和抑制霉菌等有害微生物繁殖的作用。糖类主要为可溶性糖类，包括葡萄糖、蜜饯、甜菜渣、薯渣及苹果渣等。
目前对酸化剂的研究主要集中在甲酸方面。有研究[22]证明，甲酸能使青贮饲料中70%左右的糖分保存下来， 使粗蛋白质损失率减少0.13%～0.15%;添加1%～2%的甲酸制成的青贮料， 颜色鲜绿香味浓。杨富裕(2004)[23]研究添加甲酸对白花草木樨青贮品质的影响，结果表明，加入甲酸可以显著降低草木樨青贮料的pH，乳酸和氨态氮含量著下降，乙酸含量也呈下降趋势，这一结果与郭金双[24]、Phillp[25]和Chamberlain[26]的报道一致。丁武蓉等(2008)[27]以二色胡枝子为青贮原料， 研究甲酸添加量(0、2、4、6 mL/kg 鲜重)对其青贮品质的影响，发现添加甲酸可降低胡枝子青贮饲料的pH 值和氨态氮含量，提高了青贮饲料中的可水溶性糖含量，同时显著降低青饲料中NDF 和ADF 的含量。在添加甲酸青贮可保留较多的可溶性糖方面与Carpirtero [28] 和Kennedy[29]的结果相一致。有研究显示，添加甲酸青贮可提高奶牛对青贮饲料的干物质消化率、采食量以及产奶量[30]。
糖类是乳酸菌发酵的底物，是保证青贮发酵正常进行的重要因素之一， 一般要求其含量在2%以上，如可溶性糖含量达4%以上，是制成优质青贮饲料的前提。当所选择青贮原料含糖量低不能满足青贮的基本条件时，需额外添加糖。如一些豆科牧草以及营养价值较低的秸秆在制作青贮时，需要加入可溶性糖以作为乳酸菌发酵的基质。
葡萄糖能直接为乳酸菌提供发酵底物，一般添加量为10～20 mg/kg 为宜， 但因葡萄糖价格高，不适合在生产中大量应用，而常用制糖工业、制淀粉工业的副产品糖蜜、甜菜渣、苹果渣、薯渣来代替。大量的青贮研究表明添加糖蜜可使青贮的干物质含量、乳酸含量增加，pH 值和氨态氮含量下降。李改英等(2007)[31] 研究了不同添加量的糖蜜(0%、5%、10%)对新鲜苜蓿青贮品质的影响，发现添加糖蜜明显改善了青贮饲料的感官品质，提高了粗蛋白质和乳酸含量，降低了氨态氮和总氮的比值以及饲料的pH 值。Broderick 等(2004)[32]研究了添加糖蜜的苜蓿和玉米青贮饲料对产奶乳牛生产性能的影响，结果显示，奶牛干物质摄入量、干物质和有机物消化率随着糖蜜添加量的增加线性增加。赵亮亮等(2007)[33] 在燕麦青贮中添加糖蜜也取得了良好的效果， 且ADF 含量随糖蜜浓度的增加而减少，NDF、CP 含量随添加糖蜜含量的增加而增加。除糖蜜外，近几年人们开始研究以甜菜渣[34]、薯渣[35]等含糖量较多的加工副产品作为发酵底物，将其与营养价值较低的秸秆混合青贮获得了优质的青贮饲料。
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